11.  シアノバクテリアの形質転換

シアノクバテリアの形質転換法（遺伝子導入法）

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Synechocystis sp. PCC 6803は、一般的に培養液にDNAを加えると細胞の中にDNAを取り込んで相同組換えを行ってくれる。これを自然形質転換Natural Transformationと呼ぶ。一般的に使われるGT株（Glucose-tolerant株、グルコース耐性株）などはNatural Transformationが可能であるが、かずさ株など一部に形質転換できないStrainもいるので注意が必要である。また、線毛関連遺伝子が喪失すると形質転換能を失うことが知られている。

GT株をBG-11液体培地に植菌。通常の培養条件（30℃、1% CO2、30~100 μmol photons/m2s）で２、３日間培養。

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OD730 = 1~2くらいの培養液10 ml~ 20 ml分を遠心分離で集め、１本の1.5mLチューブに濃縮する。
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形質転換するプラスミド溶液（100~300 ng/μL）1~3 μL分を培養液に加える。※量は適当で良い。
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数分間乾かしたBG-11 plate上に、ニトロセルロース膜（ミリポア、Immobilon-NC、Cat. No. HATF08250、Pore size 0.45 μm、Cut size 82 μm）を載せ、その上にプラスミド混合培養液を塗布する。可能ならば、濃度を変えて複数プレートに塗布する（例えば1枚のプレートに50 μL、もう一枚のプレートには200 μL分を塗布する）。

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明条件下、３０℃で１日間培養
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薬剤入りのBG-11プレートにメンブレンを移す。
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2、3週間培養（光強度を強めると増殖が速くなる）
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数コロニーを薬剤入りのBG-11プレートにReplate（滅菌したつまようじでストリークする）。
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数日間培養
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Replateを２、３回繰り返す。
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PCRやウエスタンブロットなどで形質転換を確認する。

 

※注意点※

1. プレートにチオ硫酸ナトリウムを入れておかないと形質転換効率が大きく低下する。

2. なぜか全く分からないが、ターンテーブル（電動でも手動でもOK）を使わないと形質転換できない。

3. メンブレンがない時は、薬剤濃度を1/5~1/10に減らしたBG-11プレートにいきなり塗布してもよい。

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※プロトコールにつきましては、必ず他の文献などもご確認ください。